超濾離心管作業(yè)工藝流程

　　1、選擇合適的超濾管主要考慮分子量和濃度：通常靶蛋白的分子量不應大于靶蛋白分子量的1/3。例如，當靶蛋白的分子量為35kDa時(shí)，可以選擇靶蛋白分子量為10kDa的超濾管。如果靶蛋白的分子量約為10kd，則可使用分子量為3kd的超濾管。

　　2、新購買(mǎi)的超濾是干燥的：使用前加入Milliq水。水的體積*覆蓋在膜上，冰浴或冰箱被預先冷卻幾分鐘。倒出水后，可以加入蛋白質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)添加量不超過(guò)管頂白線(xiàn)。超濾管在加入蛋白質(zhì)溶液前需要在冰上預先冷卻。

　　3、平衡：質(zhì)量和重心都應該平衡。注意速度和加速度不要太快，否則會(huì )直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾（離心預冷至4度）。膜和旋轉軸的方向根據說(shuō)明進(jìn)行調整（對于角向離心機，膜垂直于軸）。在實(shí)際應用中，一般的速度開(kāi)度比手動(dòng)低，可以延長(cháng)離心管的使用壽命。

　　4、當濃縮到剩余的1毫升時(shí)，取50μl布拉德福德溶液，加10μl流過(guò)，看是否變藍，以判斷UF管是否漏蛋白。如果管道泄漏，重新倒入上層，然后流過(guò)新管道開(kāi)始超濾。為了準確確定管道是否泄漏，用5mg/mlBSA離心10分鐘，然后將其穿過(guò)，大致運行膠水或Bradford，繼續添加剩余的蛋白質(zhì)溶液以濃縮（在冰上操作以防止蛋白質(zhì)加熱），直到所有濃縮物都添加完畢。離心過(guò)程中應注意是否有蛋白質(zhì)沉淀，導致堵塞。如果發(fā)生沉淀，有必要確定沉淀的具體原因是蛋白質(zhì)濃度過(guò)高還是緩沖液不當。前者可以通過(guò)多個(gè)超濾管同時(shí)超濾來(lái)降低濃度，而后者通過(guò)改變不同的緩沖液直到?jīng)]有蛋白質(zhì)沉淀。

　　5、前幾步是用來(lái)濃縮蛋白質(zhì)的，如果要更換緩沖液，當總蛋白溶液濃縮到1毫升左右時(shí)，輕輕添加一個(gè)新的緩沖液（用0.22um超濾膜超濾后），然后連續濃縮到1毫升左右。濃縮液的終體積取決于所需的蛋白質(zhì)濃度，通常不超過(guò)500ul，但也要濃縮到200ul以下。根據每次至少10次的體積濃度計算，1000次以上的3次基本可以達到更換緩沖器的目的。

　　6、提取終濃縮蛋白的操作在冰上進(jìn)行。黃色槍頭（200ul）用于提取終的蛋白質(zhì)濃縮物。槍頭沿槍頭邊緣輕輕插入。將蛋白溶液輕輕吹勻。注意不要觸摸超濾膜。吸取濃縮液，一次多吸200ul，直至耗盡。后留在管底的濃縮液不需要吸收，否則太困難，可能損壞超濾膜。后，在無(wú)超濾膜的超濾管中加入Milliq水，以防止超濾膜干燥。

　　7、將超濾管中的水倒出來(lái)，用Milliq水輕輕沖洗幾次。（如管底有可見(jiàn)蛋白質(zhì)沉淀，可先加水，再用槍頭吹氣，注意不要碰觸膜，吹氣至沉淀懸浮，再倒出，不要沖自來(lái)水）然后加入0.2mNaOH溶液，室溫放置20分鐘，平衡超濾。在此期間定量管離心10分鐘，倒出剩余的NaOH溶液，將管芯浸入Milliq燒杯（1L或2L）中。放置數小時(shí)，然后用新水替換，放置數小時(shí)，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管道和蓋子用自來(lái)水沖洗，內壁用Milliq水沖洗。

　　8、取出浸入水中的芯，并將其加入幾乎滿(mǎn)毫升的水中。在50毫升試管中注入毫升水。慢慢地將芯放入50毫升離心管中，排出一些水。然后蓋上蓋子，4攝氏度存放，直到下次使用。一般來(lái)說(shuō)，根據上述步驟和注意事項，每根渠道在三到四年內不會(huì )受損。